Küçük Elçiler: Solucanlar bize insan hastalıkları hakkında nasıl öğretir?

Bilimsel projemiz sanata layık bir gözlemle başladı-hücre dışı veziküllerin (EV'lerin) patlayıcı bir sürümü C. elegans “Burun” ve kuyruk duyusal nöronlar. Her EV, insanlarda yıkıcı polikistik böbrek hastalığına bağlı olan ve insan idrar EV'lerinin bir kargo olan bir protein olan GFP etiketli polikistin-2 taşır.

Solucanlarda, bu polikistin tomurcuk, küçük bir antik saç benzeri anten olan nöronal duyusal silyumun ucundan çevreye girer. Silyum sıradan bir hücre projeksiyonu değildir. Belirli iyon kanalları, GTPazlar ve taşıma makineleri ile kapılı, enerji aç bir bölmedir. Hücre, siliuma giren ve çıkan şeyleri düzenlemeye çok yatırım yaparsa, kesinlikle döktüğü EV'ler kazara değildir. Bu membrana bağlı parçacıklar anlamlı sinyal rolleri olan haberciler olabilir mi?

Bu soru, bu EV'lerin bellek, öğrenme, nöronal sinyal ve mekansal -zamansal kodlama ile ilişkili hücrelerden kaynaklandığını düşündüğümüzde özellikle zorlayıcı hale geldi. Siliyer EV'ler bu zor nöronal fonksiyonların bazılarına katkıda bulunabilir mi? Hipotez büyük hissetti – ama meydan okuma oldu: kişi belirli siliyer EV'lerin işlevini izlemeye nasıl başlar?

EV Kimlik Krizi

EV araştırması patlıyor. Çalışmalar, EV'leri yaralanmadan sonra doku rejenerasyonundan hastalıkta patolojik faktörlerin yayılmasına kadar her şeye bağlamıştır. Bununla birlikte, bu çalışmanın çoğu, tüm vezikül türlerinin birbirine toplandığı karmaşık sıvılardan (kan, idrar veya kültür ortamından) hasat edilen karışık EV popülasyonlarını analiz eder. Tüm şehrin posta odasını sıralayarak tek bir mektubun amacını çıkarmaya çalışmak gibi: her şey orada ve hiçbir şey spesifik değildir.

Eksik olan çözünürlük. Alan, belirli EV alt tiplerinin kargolarını tam olarak tanımlamak için uzun zamandır yoktu – özellikle de silyum gibi küçük ve uzamsal olarak kısıtlanmış bölmelerden salınan araçlar. Bu kargoları anlamak, polikistik böbrek hastalığı da dahil olmak üzere siliopatilerin patofizyolojisine ışık tutabilir.

Biyoloji Rosetta Taşı

Biyolojik bir gizemi çözmek için doğru modele ihtiyacınız var. Bizim için bu model Caenorhabditis elegansşeffaf, milimetre uzunluğunda bir solucan. Neden solucanlar? Onları Biyolojinin Rosetta Taşı olarak düşünün. Tıpkı orijinal Rosetta Stone'un dilbilimcilerin aynı metni birden çok dilde sunarak antik hiyeroglifleri deşifre etmesine izin verdiği gibi, C. elegans benzersiz bir deşifre edilebilir biyolojik sistem sunar. Genetik olarak izlenebilir, görüntüsü kolaydır ve moleküler düzeyde dikkat çekici bir şekilde korunur.

Ve çok önemli: C. elegans Siliyer EV'lerini doğrudan çevreye sokar. Bu, milyonlarca solucanı kültürleyebileceğimiz, EV'leri izole edebileceğimiz ve içeriklerini inceleyebileceğimiz anlamına geliyordu – farelerde neredeyse imkansız bir şey, analiz için yeterli politistikin EV'lerini geri kazanmak için yeterli idrar üretmiyor.

Farelerde ve insanlarda anlaşılmaz olan – özellikle EV'ler kadar heterojen ve zor olan bir şey – solucanlarda görünür ve yönetilebilir hale gelir.

EV yükünü tanımlamak için hedeflenen bir yöntem: EV-turboid

2022'de şunu gösterdik C. elegans EV'ler RNA ve çeşitli protein kargo içerir. Ancak hangi dokuların hangi kargoya katkıda bulunduğunu ve hangi proteinin politistikin EV'lerinde gerçekten birlikte paketlendiğini söyleyemedik.

Bunu çözmek için, tasarlanmış bir biyotin ligazının (Turboid) bir nanobody yoluyla polisistin-2'ye bağlandığı modüler bir yakınlık etiketleme sistemi olan EV-Turboid geliştirdik. Bu enzim, polisistin-2'nin yakınında duran proteinleri etiketleyerek polikistin EV yükünün yüksek çözünürlüklü bir “yakınlık haritası” üretir.

Binlerce ila sekiz arasında

Bulk tanımlamalarındaki önceki girişimlerimiz yaklaşık 3.000 EV aday protein verirken, EV-Turboid listeyi sekize kadar daralttı. Her aday için endojen floresan muhabirleri üretmek için CRISPR/CAS9 teknolojisini kullanarak, canlı hayvanlarda davranışlarını gerçek zamanlı olarak gözlemledik.

Üst isabetler arasında transmembran C tipi lektinler, kanal benzeri bir protein ve insan hücrelerinde bağışıklık ve büyüme faktörü sinyallerini aktarmasıyla en iyi bilinen bir traf adaptör ailesi vardı. Trafiğin daha önce kirpiklerde hiç görülmemiş olması ve onları sadece siliyer şaftın içinde değil, aynı zamanda ucunda ve içinde EV'lerde – polikistin kompleksine eşlik eden gözlemledik.

Hepsi bu değildi. Trafın proteinleri, sadece EV'lere rastgele sürüklenmediğini gördük. Yüklemeleri koşulluydu-polikistin-1'e (LOV-1) bağlı. Lov-1 olmadan, siliuma girdiler, ancak uç ve EV'lerden dışlandılar. Sanki LOV-1, veziküler kulübe girmeye izin veren moleküler bir fedai olarak hizmet etti.

İşlev, flotsam değil

Bulgularımız, EV'lerin pasif bir atık bertaraf aracı olduğu konusunda uzun süredir devam eden bir varsayımda bulundu. Bunun yerine, EV Cargo'nun küratörlüğünü ve yüklemenin Lov-1'in moleküler bir organizatör olarak hareket ettiği ve EV'ler aracılığıyla kargo alımını koordine ettiği yerlerde düzenlendiğini bulduk.

Çıkarımlar önemlidir. Polikistik böbrek hastalığında, polisistin-1'deki mutasyonlar genellikle polikistikin-2'dekinden daha şiddetlidir. Bulgularımız, bunun politistikin-1 olmadan EV'lerin hala serbest bırakıldığı-ancak sinyal yükleri eksik veya yanlış, potansiyel olarak hastalık ilerlemesine katkıda bulunduğunu göstermektedir.

Siryopati mi yoksa evopati mi?

Polikistik böbrek hastalığı gibi “siliopatiler” dediğimiz şeyin aslında “evopatiler” olabileceğini düşünmeye başlıyoruz – sadece siliumdaki yapısal kusurların değil, patolojiyi yönlendiren işlevsiz EV sinyalinin durumlarda bulunur. Teşhis ve tedaviler için geniş kapsamlı etkileri olan kışkırtıcı bir hipotezdir.

Model organizmaların güzelliği, imkansız hale getirmeleridir. İnsan biyolojisinin altında yatan moleküler komut dosyasını çözmemize izin verdiler.