Genomik DNA'nın% 70'inden fazlası gelişim sırasında çeşitli aşamalarda RNA'ya kopyalanabilse de, bunların sadece% 2'si protein dizileri için kodlar. On yıllar boyunca, bu muazzam sayıda kodlamayan RNA türü (NCRNA) “karanlık madde” olarak kabul edildi ve fonksiyonları transkripsiyonel yan ürünler veya gürültü olarak göz ardı edildi. Bu NCRNA'lar, özellikle epigenetik regülasyona katılan önemli hücresel bileşenler olarak yaygın olarak kabul edilen uzun kodlayıcı olmayan RNA'lar (özellikle 200'den fazla nükleotidin ncRNA'sı olarak tanımlanan lncRNA) üzerinde son ilgi alanları artırılmıştır. Örneğin, lncRNA xist'in dişi hücrelerde x kromozom inaktivasyonunda rol oynadığı bilinmektedir.
Uzun bir süredir, bu birçok lncrNA'nın işlevini ve geniş bir biyolojik süreç yelpazesini düzenlemede nasıl dahil olduklarının moleküler mekanizmalarını gerçekten merak ettim. LncRNA'nın bağlanma proteinlerinin hücresel bağlamda tanımlanması, biyolojik fonksiyonunun çözülmesinde çok önemli kabul edilir. Mevcut yöntemlerin çoğu, fizyolojik koşullar altında etkileşen proteinleri önyargılar ve maskeler getiren küçük moleküllü veya UV aracılı çapraz bağlamaya dayanır.
Yakınlık biyotin etiketleme teknolojisi, canlı hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için tekrar tekrar kullanılmıştır. Dr. Paul A. Khavari liderliğindeki Stanford Grubu tarafından hızlı bir şekilde adlandırılan bir yöntemin yakın tarihli bir yayını HEK293T hücrelerinde bir yabancı viral RNA'nın bağlanma proteinlerini profillemek için tasarlanmış bir biyotin-transferaz BASU kullanmak, ilginin endojen lncrNA'larının RNA bağlayıcı proteinlerini tanımlamak için benzer bir stratejiden yararlanmam için ilham verdi. Hemen, Basu'yu özellikle ilgilenilen RNA'ya yakın olarak gezinmek için sağlam RNA hedefleme CRISPR/CASRX sistemini kullanmaya karar verdim. Kısa bir süre sonra, CRispr-Assisted RNa-Protein BENnteraction DDikeksiyon (aşağıya bakınız Şekil 1). İşbirlikçim Dr Liang Zhang tarafından geliştirilen proteomik teknikle güçlendirildiğinde, Mameli hücrelerinde, örneğin TAF15 ve SNF2L'de daha önce karakterize edilmemiş birkaç bağlayıcı protein bulabilir ve doğrulayabildik ve ayrıca karpidin geniş uygulamasını gösterdi. Farklı uzunluklarda, bolluk ve hücre altı lokalizasyonlarında lncrNA'lara.
Şekil 1 | Carpid şeması. Sarı şekil, Carpid bileşenlerini ilgilenen lncRNA'ya (kök halkalı mor bir ip) bulmak ve yönlendirmek için 30 nT kılavuz RNA kullanan navigasyon sistemini (CRISPR/CAS13D) tasvir eder. Basu (CRISPR/CAS13D'ye bağlı olan şekil), bitişik bağlayıcı proteinlere (“RBP” ile gösterilir) biyotin (b) kısım ekleyebilen, parlama etiketleme kısmıdır. Streptavidin kaplı boncuklar (Myone T1), tanımlama için bağlayıcı proteinleri (“RBP”) tanımak ve saflaştırmak için kullanılır (WB: Western blot; MS: kütle spektrometrisi).
Makalemizin inceleme süreci sırasında, farklı laboratuvarlardan birkaç benzer yöntemin ortaya çıkmasına tanık olduk. Örneğin bunlar arasında, Stanford bilim adamı Dr Alice Y. Ting tarafından yönetilen bir çalışma, RNA-protein etkileşimlerini haritalamak için CASRX tabanlı APEX2 hedeflemesi, peeer incelenen platformda yayınlandı. Biorxivbaşka bir benzer yayın eşliğinde Nükleik Asitler Araştırma Zhang ve ark. Çin'deki Shanghaitech Üniversitesi'nden CRISPR/CAS13A kullanarak, yakınlık biyotin etiketleme için farklı bir sistem PUP-IT yönetmek için. Tüm bu eserler, bu tür stratejinin geniş ilgisini göstererek bizi şiddetle teşvik etti. Covid-19'un pandemi ile bakarken, viral RNA'ya bağlanan ve enfekte olmuş hücrelerde SARS-COV-2'nin yaşam döngüsünü kolaylaştırabilen hücresel proteinleri tanımlamayı amaçlayan viral RNA genomuna, hedeflerin veya viral yayılmayı etkili bir şekilde içerecek bir yolun tanımlanmasını sağlayabilen viral RNA genomuna karpid uygulamaya motive olduk.
Carpid el yazması ilk olarak Doğa Yöntemleri Eylül 2019'da tüm çok anlayışlı hakemler sayesinde iki tur revizyon ile ve son olarak 18 Mayıs 2020'de kabul edildi. Revizyon sırasında, laboratuvar çalışmasında kaçınılmaz olarak önemli kesintilere neden olan Covid-19 pandeminin sosyal huzursuzluğuyla ve patlak vermesiyle karşı karşıya kaldık. İçtenlikle pandeminin yakında kontrol edilmesini ve aynı zamanda Hong Kong ve dünyanın barışçıl bir geleceği diliyoruz.
Bundan sonra çevrimiçi yayını bulabilirsiniz: https://www.nature.com/articles/s41592-020-0866-0
Bir yanıt yazın