Progresif ailesel intrahepatik kolestaz tip 2 (PFIC2), safra tuzu ihracat pompasındaki mutasyonların neden olduğu nadir fakat yıkıcı bir pediatrik karaciğer bozukluğudur (BSEP, ABCB11 olarak da adlandırılır). Bu bozuklukla yaşayan çocuklar tipik olarak yoğun kaşıntı, ciltlerinin sararması ve yetersiz beslenmesi, sonunda son aşama karaciğer hastalığına ilerler ve genellikle bir karaciğer nakli gerektirir. ABC taşıyıcı CFTR'deki mutasyonların neden olduğu kistik fibroz dahil olmak üzere diğer protein kaçakçılığı hastalıkları gibi – PFIC2, kritik bir membran proteininin doğru hücresel konumuna ulaşamaması ve düzgün bir şekilde işlev görmesinden kaynaklanmaktadır. PFIC2 durumunda, mutasyona uğramış BSEP taşıyıcı işlevsizdir, bu da hepatositlerde safra asidi retansiyonuna ve hücresel hasar ile sonuçlanır.
Bunlar gibi protein katlanır hastalıklarda, lokal yapısal elementlerin katlanması, protein alanları veya çok alanlı proteinlerin arızalı montajı, missense mutasyonlarından etkilenebilir. Hücresel ortama ve spesifik katlama yollarına bağlı olarak, yanlış katlanmış proteinlerin hücresel protein kalite kontrol makineleri tarafından tanındığı ve bozulma için hedeflenen mekanizmalar değişebilir. Birçok çalışma, protein katlama kusurlarının genellikle nascuse veya tamamen katlanmış proteinin termodinamik stabilitesinde bir azalmaya yol açtığını ve hedef proteinin erime sıcaklığının deneysel olarak belirlenmesi yoluyla doğrudan gözlemlenebileceğini göstermiştir.
Çalışmamız, BSEP'deki spesifik missense mutasyonlarının, insan ticareti ve işlevinin restore edilebileceği protein yapısındaki ilaçlanabilir sıcak noktaları tanımlama umuduyla protein dengesizleşmesine ve insan ticareti başarısızlığına nasıl yol açtığını anlamaya odaklandı.
Moleküler düzeyde BSEP disfonksiyonunu açma
BSEP ve ABCB4 ile bağlantılı olanlar da dahil olmak üzere hepatobilier hastalıklarda protein kaçakçılığı bozukluklarının farkındalığına rağmen, safra asidi biyolojisinde yer alan başka bir kritik membran taşıyıcı proteini, PFIC2'deki BSEP disfonksiyonunun altında yatan moleküler detaylar, tamamen anlaşılmıştır.
Bunu ele almak için klinik olarak gözlenen BSEP varyantlarının bir panelini sistematik olarak değerlendirmek için CETSA (hücresel termal kaydırma deneyleri), immünoblotlama ve immünofloresan kullandık. Sadece son on yılda geliştirilen bir yöntem olan Cetsa, bir proteinin erime sıcaklığını hücresel ortamı bağlamında belirleyebilir. Uygun katlama, hücresel lokalizasyon ve fonksiyon için gerekli olabilecek şaperonlar veya aksesuar proteinleri ile etkileşimler de dahil olmak üzere, tam proteostaz ağında katlanmanın enerjisini karakterize etme avantajına sahiptir.
Bu dik yaklaşımlar, özellikle BSEP proteininin NBD2 bölgesine lokalize olan bir mutasyon kümesinde yakınsak bir dengesizlik paterni ortaya çıkardı – bizi yapısal instabilite bu sıcak noktaya odaklanmamıza neden olan ipuçları.
Yeni bir yapısal bakış açısı
Daha derin mekanik içgörü elde etmek için, yüksek çözünürlükte patojenik bir mutant BSEP'nin (E297G) kriyo-em yapısını belirledik. Yapı, NBD2 bölgesinde biyokimyasal verileri destekleyen ve kaçakçılık ve işlev bozukluğu için potansiyel bir açıklama sunan bozukluğu ortaya koydu. Bu, bilgimize göre, klinik olarak anlamlı bir BSEP mutantının ilk kriyo-EM yapısıdır ve mutasyonların ABC taşıyıcı katlanmasını nasıl bozduğunu anlamak için değerli bir çerçeve sağlar.
İleriye Bakış
Biyofiziksel, immünofloresan ve yapısal analizler yoluyla, BSEP varyantlarının termodinamik stabilitesi, hücresel lokalizasyonu ve ilişkili hastalıkların şiddeti arasında açık bir korelasyon gösterdik. Özellikle, CETSA deneylerimiz, protein katlama ve fonksiyonu için kritik bir bölge olan NBD2-ICL2 arayüzünde önemli dengesizleştirme belirlemiştir. Ayrıca, BSEP E297G varyantının kriyo-EM yapısı, muhtemelen bu oldukça dengesizleştirici mutasyonun bir sonucu olarak NBD2'de önemli bozukluğun doğrudan yapısal doğrulanmasını sağlar.
ABC taşıyıcıları içinde dengesizleştirme için sıcak noktaların keşfedilmesi, bazı protein sınıflarının doğası gereği stabilizasyonun kenarında yer aldığı fikrini desteklemektedir. Bu proteinler, konformasyonel durumlar arasındaki geçişler için etkili bir şekilde işlev görmesi için düşük enerji bariyerleri gerektirir, bu da BSEP gibi ABC taşıyıcıları için, substratların biyolojik membranlar arasında taşınmasını kolaylaştırmak için iç ve dışa dönük konformasyonlar arasında karşılıklı dönüşümü içerir. Fonksiyon için gerekli olsa da, bu doğal istikrarsızlık, bu bölgeleri hastalığa yol açabilecek dengesizleştirici mutasyonlara duyarlı hale getirebilir.
Çalışmamız, spesifik dengesizleştirici mutasyonları haritalayarak ve yapısal sonuçlarını görselleştirerek, PFIC2'li hastalar için ve potansiyel olarak primer sklerozan kollantit gibi safra tuz taşınmasında disfonksiyon ile karakterize edilen ilave hepatobilier hastalıklar için işlevi sağlayabilen hassas terapötiklere doğru bir yol sunmaktadır.
Bu bulgular, taşıyıcı fonksiyonunu geri yükleyebilen ve geliştirebilen küçük molekül düzelticilerin ve potansatörlerin rasyonel tasarımını bilgilendirme potansiyeline sahiptir. Daha genel olarak, moleküler düzeyde membran proteini yanlış katlanmasının neden olduğu hastalıkları ele alma çabalarına katkıda bulunurlar.
Bir yanıt yazın